Papel de la metaloproteinasa MT4-MMP durante el proceso de angiogénesis en el cerebro en desarrollo

Abstract

La angiogénesis es el proceso fisiológico que implica el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes durante el desarrollo embrionario. Se basa en la migración de las células endoteliales que ocurre principalmente de manera dependiente a las proteasas que degradan la matriz extracelular. Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) son buenas candidatas en la regulación de la angiogénesis por brotes. Dentro de este grupo se encuentra MT4-MMP, una proteinasa anclada a la membrana a través de un dominio glicosilfosfatidilinositol (GPI), que participa en la angiogénesis tumoral contribuyendo en la maduración y estabilización de los vasos durante la progresión del tumor. Sin embargo, el papel de esta enzima en la formación de los vasos sanguíneos durante la embriogénesis sigue siendo desconocido. Estudios previos de nuestro laboratorio han demostrado el patrón de expresión de MT4-MMP a lo largo del desarrollo embrionario del ratón. Concretamente, durante la formación del sistema vascular, MT4-MMP se expresa en el plexo vascular perineural y en las células endoteliales de los vasos sanguíneos que migran y entran al tejido neural embrionario.

Tras confirmar la expresión de MT4-MMP en el tubo neural y el rombencéfalo embrionario, nuestros resultados sugieren que dicha enzima es necesaria para la correcta angiogénesis del plexo vascular de la región subventricular del rombencéfalo. El análisis del fenotipo vascular usando como modelo de estudio el rombencéfalo embrionario de ratones deficientes en MT4-MMP (Mt4-mmp-/-) reveló defectos que afectaban tanto a la angiogénesis del plexo vascular como a la microglía al compararlo con embriones de tipo salvaje (Mt4-mmp+/+). Además, ensayos in vitro que permiten evaluar la migración de las células endoteliales dirigida por estímulos quimiotácticos, demostraron que la presencia de MT4-MMP es necesaria para la migración endotelial inducida por VEGF y en menor medida por CXCL12.

Por otra parte, para dilucidar si los defectos observados en los embriones que no expresan Mt4-mmp son consecuencia directa de la ausencia de dicha metaloproteinasa en las células endoteliales, hemos analizado el fenotipo vascular en ratones que tienen delecionado Mt4-mmp específicamente en las células endoteliales (Mt4-mmpiEC). Esta línea se generó mediante el cruce de ratones que expresaban la recombinasa Cre inducible por tamoxifeno bajo el control del promotor de la cadherina 5 endotelial vascular (Ve-Cdh5)-CreERT2 con ratones que tenían el exón 2 de Mt4-mmp flanqueados por sitios loxP (Mt4-mmploxP/loxP). Los resultados muestran que la eliminación específica de MT4-MMP en el endotelio tiene repercusiones importantes en el fenotipo vascular del rombencéfalo embrionario generando una angiogénesis aberrante en la zona subventricular. En este contexto, la falta de MT4-MMP compromete tanto el número como la morfología de los macrófagos embrionarios que juegan un papel importante en este proceso.

En conjunto, los resultados de este trabajo demuestran que MT4-MMP desempeña un papel importante durante la angiogénesis embrionaria y que la deleción específica de la metaloproteinasa en las células endoteliales perjudica gravemente la vascularización del plexo subventricular del rombencéfalo embrionario. Así, la ausencia de MT4-MMP afecta a la migración de la célula endotelial además de tener una influencia sobre la microglía embrionaria.

Angiogenesis is the physiological process involving the growth of new blood vessels from pre-existing vessels during embryonic development. It is based on the migration of endothelial cells that occurs in a manner dependent on proteases that degrade the extracellular matrix. Matrix metalloproteinases (MMPs) are good candidates in the regulation of sprouting angiogenesis. Within this group is included MT4-MMP, a matrix metalloproteinase anchored to the cell membrane through a glycosylphosphatidylinositol (GPI) domain, which participates in tumor angiogenesis by contributing to the maturation and stabilization of vessels during tumor progression. However, the role of this enzyme in vessel formation during embryogenesis remains unknown. Previous studies from our laboratory have demonstrated the expression pattern of MT4-MMP throughout mouse embryonic development. Specifically, during the formation of the vascular system, MT4-MMP is expressed in the perineural vascular plexus and in the endothelial cells of blood vessels that migrate and enter the embryonic neural tissue After confirming the expression of MT4-MMP in the neural tube and the embryonic hindbrain, our results suggest that this enzyme is necessary for the correct angiogenesis of the vascular plexus in the subventricular region of the hindbrain. Analysis of the vascular phenotype using the embryonic hindbrain of Mt4-mmp deficient mice (Mt4-mmp-/- ) revealed defects in angiogenesis when compared with wild-type (Mt4-mmp+/+) embryos. Furthermore, in vitro assays to assess endothelial cell migration directed by chemotactic stimuli demonstrated that the presence of MT4-MMP is required for endothelial cell migration induced by VEGF and to a lesser extent by CXCL12.

Moreover, to elucidate whether these defects observed in the mutant hindbrain are a direct consequence of the absence of MT4-MMP in endothelial cells, we analyzed the vascular phenotype in mice that have deleted this metalloproteinase specifically in endothelial cells (Mt4-mmpiΔEC). This line was generated by crossing mice expressing tamoxifen-inducible Cre recombinase under the control of the vascular endothelial cadherin 5 promoter (Ve-Cdh5)- CreERT2 with mice having Mt4-mmp exon 2 flanked by loxP sites (Mt4- mmploxP/loxP). The results show that the specific deletion of MT4-MMP in the endothelium has important consequences on embryonic hindbrain angiogenesis as it results in an aberrant angiogenesis in the subventricular zone. In this context, the lack of MT4-MMP compromises both the number and morphology of embryonic macrophages that play an important role in angiogenesis.

Taken together, the results of this work demonstrate that MT4-MMP develops an important role during embryonic angiogenesis and the specific deletion of this metalloproteinase in endothelial cells severely impairs vascularization of the subventricular plexus of the embryonic hindbrain. Moreover, this action of MT4-MMP is not only affecting the endothelial cell, but seems to affect embryonic microglia as well.